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一步法荧光探针RT-PCR试剂盒(高含量ROX)图片
产品货号:
WE0150
中文名称:
一步法荧光探针RT-PCR试剂盒(高含量ROX)
英文名称:
BaldStar TaqMan One-Step RT-qPCR Kit(High ROX)
产品规格:
100次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

本制品是采用探针法(TaqMan,Molecular Beacon等)进行一步法Real-Time RTqPCR的专用试剂盒。使用本制品进行Real Time RT-qPCR反应时,逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行,反应过程中无需添加试剂,无需打开管盖,避免了污染的同时提高了实验效率。本制品的检测灵敏度高,荧光信号强,信噪比高,非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。其所包含的特殊缓冲系统能使逆转录酶与DNA聚合酶同时发挥最大功效,提高反应效率。使用本制品可以得到更宽广的线性范围,对目的基因定量更准确,重复性好,可信度高。




ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差,一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同,因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
  • 不需要ROX校正的仪器(WE0148):
    Roche LightCycler 480,Roche LightCyler 96,Bio-rad iCyler iQ,iQ5,CFX96等。
  • 需要Low ROX校正的仪器(WE0149):
    ABI Prism7500/7500 Fast,QuantStudio 3 System,QuantStudio 5 System,QuantStudio 6 Flex System,QuantStudio 7 Flex System,ViiA 7 system,Stratagene Mx3000/Mx3005P,Corbett Rotor Gene 3000等。
  • 需要High ROX校正的仪器(WE0150):
    ABI Prism7000/7300/7700/7900,Eppendorf,ABI Step One/Step One Plus等。



组分WE0148WE0149WE0150
2×BaldStar TaqMan One-Step Buffer1.4mL1.4mL1.4mL
BaldStar TaqMan One-Step Enzyme Mix100μL100μL100μL
50×Low ROX-50μL-
50×High ROX--50μL
RNase-Free Water1.5mL1.5mL1.5mL

保存:-20℃,避光,避免反复冻融。


  • 本试剂盒中试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀,尽量避免起泡,并经短暂离心后使用。
  • 本制品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验,在操作过程中应避免RNase污染,建议在专门的区域进行RNA操作,使用专门的仪器和耗材,操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套,实验相关耗材应用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时,并高压灭菌30分钟后使用。
  • 本试剂盒中的各试剂应尽量避免反复冻融,反复冻融可能使产品性能下降。
  • 本试剂盒必须使用特异性引物,引物的选择可根据具体实验来选择,引物设计的好坏直接影响到RT-qPCR反应的结果,设计引物时需考虑GC含量,引物长度,引物位置,PCR产物的二级结构等因素,建议采用专业的引物设计软件进行设计。
  • 本试剂盒推荐使用特异性探针,建议采用专业的设计软件进行设计。



以下举例为常规的反应体系和反应条件,实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小的不同进行相应的改进和优化。(反应液的配置请在冰上进行)
  • 将RNA模板、引物、2×BaldStar Probe One-Step Buffer、BaldStar Probe One-Step Enzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
  • 配制PCR反应体系:
    成分用量终浓度
    2×BaldStar TaqMan One-Step Buffer12.5μL
    Forward Primer,10μM0.5μL0.2μM
    Reverse Primer,10μM0.5μL0.2μM
    Probe,10μM0.5μL0.2μM
    BaldStar TaqMan One-Step Enzyme Mix1μL
    RNA TemplateX μL10pg~100ng
    50×ROX(可选)0.5μL
    RNase-Free Water至25μL
    注意:
    • 通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果,可以在0.1~1.0μM作为设定范围的参考。
    • 使用的探针浓度,与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关,实际使用时请参照仪器说明书,或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
    • 通常RNA模板的量以10pg~100ng为参照,因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同,可对模板进行梯度稀释,以确定最佳的模板使用量。
    • 不同仪器的激发光学系统有所不同,根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX、50×High ROX或不加ROX。
  • 混匀,短暂离心,将溶液收集到管底。
  • 设置RT-PCR反应程序:
    步骤温度时间循环数
    逆转录45℃10min1
    PCR预变性95℃10min1
    变性95℃15s30~40
    退火/延伸60℃45s
    注意:
    • 本制品所采用的热启动酶须在预变性95℃、5~10min条件下实现酶的活化。
    • 建议采用两步法PCR反应程序,若因使用Tm值较低的引物等原因,得不到良好的实验结果时,可尝试进行三步法PCR扩增,退火温度请以56℃~64℃的范围作为设定参考。

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