产品目录

本制品是采用探针法（TaqMan，Molecular Beacon等）进行一步法Real-Time RTqPCR的专用试剂盒。使用本制品进行Real Time RT-qPCR反应时，逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免了污染的同时提高了实验效率。本制品的检测灵敏度高，荧光信号强，信噪比高，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。其所包含的特殊缓冲系统能使逆转录酶与DNA聚合酶同时发挥最大功效，提高反应效率。使用本制品可以得到更宽广的线性范围，对目的基因定量更准确，重复性好，可信度高。

• 不需要ROX校正的仪器（WE0148）:
  Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
  
• 需要Low ROX校正的仪器（WE0149）：
  ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio 3 System，QuantStudio 5 System，QuantStudio 6 Flex System，QuantStudio 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
  
• 需要High ROX校正的仪器（WE0150）：
  ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

• 本试剂盒中试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
  
• 本制品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验，在操作过程中应避免RNase污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃处理12小时，并高压灭菌30分钟后使用。
  
• 本试剂盒中的各试剂应尽量避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。
  
• 本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-qPCR反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件进行设计。
  
• 本试剂盒推荐使用特异性探针，建议采用专业的设计软件进行设计。

• 将RNA模板、引物、2×BaldStar Probe One-Step Buffer、BaldStar Probe One-Step Enzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
  
• 配制PCR反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×BaldStar TaqMan One-Step Buffer	12.5μL	1×
  Forward Primer,10μM	0.5μL	0.2μM
  Reverse Primer,10μM	0.5μL	0.2μM
  Probe,10μM	0.5μL	0.2μM
  BaldStar TaqMan One-Step Enzyme Mix	1μL
  RNA Template	X μL	10pg～100ng
  50×ROX(可选)	0.5μL	1×
  RNase-Free Water	至25μL

  注意：
  
  • 通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1～1.0μM作为设定范围的参考。
    
  • 使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
    
  • 通常RNA模板的量以10pg～100ng为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
    
  • 不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX、50×High ROX或不加ROX。
• 混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
  
• 设置RT-PCR反应程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  逆转录	45℃	10min	1
  PCR预变性	95℃	10min	1
  变性	95℃	15s	30～40
  退火/延伸	60℃	45s

  注意：
  
  • 本制品所采用的热启动酶须在预变性95℃、5～10min条件下实现酶的活化。
    
  • 建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以56℃～64℃的范围作为设定参考。